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多抗亲和层析纯化

多抗的纯化是一件比较简单的事情,因为人工干预比较大,所以对实验者的操作依赖性较强。很多新手觉得这是一件比较复杂困难的工作,但是如果理解了原理,就可以自行改进实验了。多抗纯化方法比较多,过去有用盐析法纯化的,有用辛酸-硫酸铵沉淀的方式纯化的,也有用冷酒精沉淀的方式纯化的,也有后来的离子交换层析和Protein A、G、A/G 纯化的,但是在今天,市场上几乎所有的抗体都是通过抗原亲和纯化得到的,与其它方法相比,抗原亲和层析得到的抗体效率高、产量高、产品纯、操作简单。鉴于很多网友问起这方面的问题,我就详细地讲一讲亲和纯化原理和操作。
说到亲和层析,还得从上个世纪60年代说起。当年美国NIH(National Institutes of Health)
有个学生在研究一种酶和抑制剂之间的相互作用的时候,突发奇想:既然此酶可以和抑制剂结合,那如果把抑制剂固定起来,不就可以用来纯化酶了吗?试了一下觉得果然可行于是发了论文,从那之后,就出现了各种各样的亲和层析,亲和配基与配体可以是酶与底物、酶与抑制剂、激素与受体、抗原和抗体、糖蛋白与凝集素、生物素与亲和素、组氨酸与二价金属离子、卟啉环与亚铁离子等。亲和层析精髓:将一种分子固定,用来吸附另一种特异性分子,最后将其洗脱下来。
言规正传,多抗的亲和层析是基于抗原与抗体结合的一种层析方式。基本思路是将抗原固定在一种基质(也就是柱的填料,大家都叫介质或beads)上,然后与抗血清孵育以捕获相应的抗体,然后从基质上洗掉非特异性结合的抗体,最后再将抗体洗脱下来。一个经典的亲和纯化流程如下:

(1)介质的制备目前大部分亲和柱介质都是基于琼脂糖(Agarose)或者葡聚糖(Dextran)。由于琼脂糖稳定性好、对蛋白质的非特异性吸附低、适宜活化,因此是制备抗原亲和柱介质的理想材料。单纯的琼脂糖是不能和蛋白质直接相连的,因此需要给它加一个有活性的臂,这就有点类似多肽与载体蛋白的偶联需要一个双功能试剂一样。琼脂糖加臂(活化)的方法比较多,其中涉及的原理也和多肽与载体蛋白偶联类似,最常用的活化试剂是溴化氰和环氧氯丙烷,另外二溴丙醇、N,N'-羰基二咪唑、双环氧化物等也可以用来活化琼脂
糖。
溴化氰对琼脂糖的活化机理如下:



环氧氯丙烷活化机理如下:

关于如何操作的问题,可以参考文献。如果你想自己制备,为了你和他人的安全,请不要使用溴化氰活化,溴化氰有剧毒,极微量的摄入都有可能造成死亡,本人对此类事故不负任何责任。如果是单纯做一次或几次小量抗原亲和纯化,建议购买商品化的介质,GE Healthcare 就有卖的(Cat. NO.为17-0430-01)。以下的介绍就基于此介质说明书展开叙述的。使用此种介质首先需要将其进行预处理,预处理方法是:称取适量的介质(一般0.5g介质可以一次性纯化10ml 左右血清,可以反复使用)倒入pH 2.0 HCl 中,4℃让其吸胀15min,体积膨胀比例为:1g 可以膨胀至3.5ml,然后将其装入漏斗中,用pH2.0 HCl 充分洗涤(体积为介质膨胀后的50倍以上)以除去保护剂。千万不可用中性或碱性试剂洗涤,否则介质会水解。
(2)抗原与介质的连接这一步是整个纯化过程中最关键的一步,如果在这一步上有什么失误,建议你从第一步重新开始吧。首先要注意一点:常见的连接方法都基于抗原上的游离氨基或者巯基与活化后的介质的连接,因此体系中不应该有其它含有氨基或巯基的化合物,包括尿素、硫脲、盐酸胍、Tris、铵根离子、β-巯基乙醇等,如果有这些物质在体系中,应该首先设法除去。
溴化氰活化的琼脂糖与氨基化合物反应的机理如下:

环氧氯丙烷活化的琼脂糖与氨基化合物反应的机理如下:

连接反应进行的条件:① 缓冲体系。上述两个连接反应都应该在碱性环境下进行。pH宜在8-10之间,推荐使用Na2CO3-NaHCO3体系,pH 尽量偏离蛋白的等电点,但不可高于10,否则介质很容易水解。pH 也不能过低,否则抗原的氨基或巯基会被质子化,无法与介质结合。也可以考虑用其它的缓冲体系,但是绝对不可引入带有游离氨基或者巯基的化合物。为了防止蛋白类抗原的聚集,体系中还可以加入0.5M NaCl 以提高盐离子浓度。② 蛋白质浓度。为了达到比较快而且比较彻底的反应,抗原浓度应尽量提高(也就是高中课本上讲的勒沙特列原理),但过高的浓度有可能造成聚集形成沉淀。一般推荐浓度是5-10mg/ml。需要注意的是介质的承载量并没有这么大。用来连接的蛋白在缓冲体系中必须完全溶解,如果不能溶解可以尝试加入去垢剂,多肽等小分子化合物可以用DMSO、DMF、二氧六环助溶。③ 反应温度与时间。此反应可以在室温进行,一般来说,室温4小时反应足够完成,如果担心抗原降解,可以在4℃进行,需要过夜反应。
(3)连接效果的评估有经验的同仁这一步基本可以不做,但是对于新手来说做了这一步心里更有谱一些。这个过程尽量用比较简单的实验来做比较好,推荐使用考马斯亮蓝法(Bradford 法),但是体系中如果含有去垢剂,建议改用其它的方法(如BCA、Lowery、凯氏定氮法等),也可以取连接后的上清液(离心后)拿去做SDS-PAGE 判断。确认连接没有问题后,以将体系转入柱子里除去连接后的液体,如果没有柱子,也可以用离心的方法进行,下同。
(4)多余位点的封闭为了保证连接效率,介质的量通常是过量的,因此连接完后,介质上就有很多多余的空位点,如果不把它们封闭,那接下来的一步里就会与血清中的抗体结合,这样就会影响抗体得率。含有氨基的小分子化合物都可以用来进行封闭,如尿素、Tris、乙醇氨、单一氨基酸等,大分子物质是不适宜用来封闭的,因为它们的空间位阻会影响下一步中抗体与抗原的结合。封闭条件与连接条件基本类似。封闭完成后,除去封闭液,用PBS洗柱三次。
(5)抗血清与介质的结合血清事先经过10000g 离心5min,有条件的还可以通过0.45μm滤膜过滤。将血清用PBS 稀释一倍,然后加入连好抗原的介质,密封好,4℃摇晃过液或者室温摇晃3至4小时,摇晃时最好能颠倒来回摇动,确保所有介质都能悬在液体中。室温孵育时间不宜过长,否则会引起非特异性吸附,同时影响抗体质量。
(6)非特异性结合的抗体的洗涤第5步完成后,过柱或者离心去掉血清成份,用PBS洗涤三次。然后再用一个稍稍Harsh 一点的体系去洗掉与抗原非特异性结合的蛋白,怎么样的体系算是比较Harsh 呢? 一种是偏酸或偏碱一点的pH,可以加酸或加碱将PBS 或生理盐水的pH 调至偏酸(5.0)或偏碱(8.5)作为洗涤液,用10倍柱体积洗柱一次,也可以直接用150mM Gly,基本不用调pH 就是pH=5.0了。另一种体系是高盐离子浓度,例如可以在PBS 里加入NaCl 至终浓度为1M,10倍柱体积洗涤一次。两种体系的本质都是减弱蛋白质分子间的作用力。
(7)洗脱经过第6步的操作后,结合在柱上的抗体就非常纯了,同时那些亲和力弱的抗体也被洗掉,于是可以开始洗脱了。洗脱方法和上面的洗涤原理基本类似,只是条件更苛刻一点。通常用得比较多的办法是用pH 2.5左右的HCl(含150mM NaCl)洗脱,也可以采用碱性洗脱液洗脱。洗脱有两种方式,一种是连续洗脱,另一种是不连续洗脱。前者是连续入加洗脱液,即时监控洗脱情况并随时决定收集目的抗体组分。不连续洗脱则是分批加入洗脱液,分批收集洗脱流出的成份,最后再对每一次收集的组分检测。如果用前一种方法,最好有一台紫外监测仪检测流出组分以便即时监控,后一种方法的检测则相对比较简单一些,只要是可以对蛋白质进行定量的方法都可以使用(如Bradford 法、Lowery 法、BCA 法等都可以),总之就是越简单越好。洗脱过程尽里在低温完成,洗脱下的组分应该在冰盒上放置,洗脱下来后的成份应该立即调节pH 至中性,调节pH 应该使用缓冲液,而不应该直接使用强酸或强碱,Na2HPO4、Na2CO3和Tris 等缓冲液是用来作为中和液的不错选择。需要指出的是,如果需要将抗体进行偶联荧光素或者酶的时候,就不能使用Tris 作为中和液,否则会影响后面的边接效率。
(8)抗体的保存抗体纯化完后,必须采取合适的保存,否则很容易就失去活性。总的来说有这么几个方面需要注意:① 缓冲体系。纯化后的抗体必须处于一个相对接近体液的缓冲体系中,一般的PBS 体系就足够了。注意不要引入高浓度的离子,尤其是金属离子。不要引入干扰抗体实验的离子或基团。② 防腐剂。为了防止抗体长菌,必须加入防腐剂,常见的防腐剂有:叠氮钠、硫柳汞、抗生素(庆大霉素)。叠氮钠的常用浓度是0.02%,硫柳汞和庆大霉素的常用浓度为0.01%,其中叠氮钠会抑制HRP 酶活性,因此在需要偶联HRP酶的抗体中不能加这种防腐剂,而且叠氮钠会影响细胞色素氧化酶活性,会干扰机体的呼吸作用,因此操作时需要注意安全。硫柳汞对儿童具有潜在毒性,使用时也应注意。③ 稳定剂。向抗体中加入稳定剂可以增加其稳定性,常见的稳定剂有多羟基类化合物(二元醇、三元醇等,如浓度为30%-50%的甘油、乙二醇)、二糖类物质(如蔗糖、海藻糖等)、氨基酸、蛋白质(如BSA 等),如果抗体需要进行标记,则不可以加入氨基酸、BSA 等保护剂。④温度。长期不用时,抗体应该低温保存,一般采用-20℃保存。短期不用可以放在4℃,但不要超过一周。抗体绝对要避免反复冻融,前面提到的加入甘油等既可以起稳定作用,还可以起防冻的作用。如果有条件,可以把抗体进行冷冻干燥形成冻干粉,放在-80℃。如果抗体尚未纯化,直接以血清的方式保存在-20℃以下,也可以很好地保证其活性。⑤ 浓度。和普通蛋白质一样,浓度越高就越利于保存。如果抗体浓度太低,可以采用超滤、protein A 或Protein G(操作方法参考单抗纯化相关介绍)、透析袋等方式浓缩。超滤的方式操作简单,直接将抗体装入超滤管再进行离心即可。透析袋浓缩操作也比较简单,将PEG(分子量大于8000)配成50%左右的溶液,用合适孔径的透析袋装好抗体,然后放入PEG 溶液中搅拌浓缩即可。关于Protein A 或Protein G 浓缩的方法将在单抗纯化相关部分讲述,需要指出的是这用这两种亲和柱浓缩的损失可能比较大。⑥ 存储时间。抗体在-20℃并含有甘油的情况下可以存放数年至十几年(不要反复拿至温室)。在4℃存放的时间一般在一个月左右就可以有明显的效价变化。冷冻干燥的冻干粉低温可放置几十年。


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